无血清细胞培养基迎来发展窗口期（二）

2、HEK293细胞

人类细胞系也是一种重要的生产人源化糖蛋白的宿主细胞，现阶段用的比较多的就是HEK293细胞，即人胚胎肾细胞。2014年FDA或EMA批准了几个应用人类细胞系生产的治疗性蛋白，如防血友病A和B型流血发作的rFVIIIFc和rFIXFc。

3、BHK细胞系

幼年仓鼠肾细胞（BHK，baby hamster kidney cell）1961年分离建立细胞系，1963年获得单克隆细胞。BHK细胞常用于疫苗的生产，目前只有凝血因子Ⅶa和Ⅷ两种重组糖蛋白是用BHK细胞生产的。

（三）细胞培养工艺

工业生产治疗性蛋白工艺都是生物反应器。生产反应器种类主要包括机械搅拌式生物反应器和一次性抛弃式WAVE反应器。

机械搅拌式生物反应器，要求搅拌时剪切力小，混合性能好，如笼式通气搅拌生物反应器、离心式搅拌器细胞培养反应器；

一次性抛弃式WAVE反应器，由GE公司1998年进行商品化生产，温和的波浪式运动可以起到很好的供氧和混合的目的，运动产生的剪切力也很小，支持高密度大规模细胞培养，替代不锈钢发酵罐。

CDMO工艺开发，一般生物反应器工艺放大到200L；根据药物使用剂量，临床阶段生物反应器需要200-500L；新药上市后，一般生物反应器为2,000L以上，单位成本处于较低水平。

抗体及重组蛋白生物反应器产能和单位成本关系如下所示：

生物反应器细胞培养的主要方式包括批式培养、流加培养及灌流工艺。

批式培养：将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间后，将整个反应系取出。

流加培养：先将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器，使细胞进一步生长代谢，到反应终止时取出整个反应系；

灌流工艺：将细胞种子和培养液一起加入反应器进行培养，一边加入新的培养液，另一边将反应液取出，使得反应条件处于一种稳定状态。

2细胞培养基

（一）动物细胞培养基发展历史

1、天然培养基阶段

1907年，利用青蛙淋巴液培养青蛙神经纤维，淋巴液为最早的天然培养基。1909年，Burrows发现淋巴液不适合培养恒温动物的细胞，用血浆成功培养了鸡胚细胞和动物细胞，血清成为细胞培养的主流培养基。

2、基础培养基阶段

科学家对血清成分进行分析，研究支持细胞成长的成分，以合成细胞培养基。1955年Eagle通过实验验证13种氨基酸和8种维生素是必要成分，并开发了MEM（minimum essential medium）培养基配方，包括葡萄糖、6种无机盐、13种氨基酸、8种维生素和透析血浆。

根据不同细胞系、不同培养目的对MEM配方进行优化，Dulbecco优化后的培养基为DMEM(Dulbecco modified eagle medium)，为目前基础研究中应用最为广泛的培养基，是所有生物制药工程细胞用培养基的研究基石。

1976年Ham研发团队发现亚硒酸盐是细胞培养基的必要组分，科学家还发现转铁蛋白、白蛋白，几种激素及生长因子的组合是血清的替代物，从而多种无血清培养基被开发出来。

研究者将几种必要组分直接组合成血清替代物，如胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸盐组成ITS，Hiroki Murakami等人发现乙醇胺对于杂交瘤细胞培养是必要的，因此与ITS组合成ITES。

由于天然培养基的一些成分仍不清楚，不能用已知的化学成分代替，因此一般要加入10%的血清。杂交瘤细胞培养中，添加血清浓度更高，一般为10%-20%。血清的加入对培养非常有效，但是提高了细胞表达蛋白的分离、纯化及检测的工艺复杂性和成本。因此，细胞培养基的研发方向就是降低血清浓度甚至不添加血清。